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評估克雷伯氏肺炎菌利用hipBA 毒素抗毒素系統表現頑固抗性之機轉= Assessing the persistence mechanism of hipA/hipB toxin/antitoxin system in Klebsiella pneumoniae/

紀錄類型:	書目-語言資料,印刷品 : Monograph/item
正題名/作者:	評估克雷伯氏肺炎菌利用hipBA 毒素抗毒素系統表現頑固抗性之機轉= / 劉冠宏
其他題名:	Assessing the persistence mechanism of hipA/hipB toxin/antitoxin system in Klebsiella pneumoniae/
其他題名:	Assessing the persistence mechanism of hipA/hipB toxin/antitoxin system in Klebsiella pneumoniae
作者:	劉冠宏
出版者:	[高雄市]: [撰者], : 民111,
面頁冊數:	95葉: 圖; : 30公分;
附註:	指導教授: 曾嵩斌.
提要註:	克雷伯氏肺炎菌是一種伺機性感染的病原體，平時以正常菌叢的形式存在於健康人體腸道、呼吸道…等環境中，當人體免疫功能低下或產生缺陷時便會造成嚴重的感染，現今克雷伯氏肺炎菌抗藥性問題與日俱增，因此許多研究試圖釐清其中機制以尋求解決辦法。近年來研究發現細菌除了可透過基因突變或是獲得抗藥性基因的方式產生抗藥性以外，還存在一群基因型一致但表現型不同的亞族群可在長期的抗生素治療中存活，後來的研究將其命名為頑固性細菌 (persister cell)。頑固抗性 (persistence)被定義為正常細胞的表現型變異，細菌可以透過抑制生長的方式進入休眠狀態以暫時抵抗抗生素壓力，且當抗生素環境壓力被去除後便能夠重新恢復生長，而這樣的特性會導致病患反覆感染、治療難度上升。在過去的十年間許多學者試圖釐清頑固抗性的機制，而其中毒素抗毒素系統已被證實與頑固抗性具有高度相關性，其中又以第二型毒素抗毒素系統hipBA最廣為研究，當細菌面對環境壓力時，體內的蛋白酶會水解抗毒素從而釋出毒素，自由態的毒素會結合其標的使細菌生長受到抑制並從而誘導頑固抗性的表現。綜合上述，本研究試圖探討第二型毒素抗毒素系統hipBA對於K. pneumoniae頑固抗性表現的相關性，本實驗分析臨床收集共25隻Carbapenem-和colistin-resistant K. pneumoniae (CRKP)的hipA序列後，挑選3種位於HipB抗毒素辨認位的基因突變 (V11A、R18H、D73E)及3種位於調節下游基因的核酸結合位的基因突變 (Q166H、A264S、R385L)進行後續研究，並以自肝膿瘍病人分離出的克雷伯氏肺炎菌 (K. pneumoniae NVT2001SN)為原始株利用質體pKASsacB建構ΔhipA及ΔhipBA的突變菌株，且利用南方墨點法驗證基因剔除的正確性。此外，在調節表現質體pBAD18建構不同定點突變hipA後，以生長曲線、毒素過表達試驗及population analysis profile (PAP)等試驗探討hipBA基因是否影響細菌生長、抗生素頑固抗性的表現，以及該6種單一胺基酸取代對於HipA功能的影響。本研究結果顯示，在生長曲線實驗中發現剔除hipA或hipBA並不影響K. pneumoniae NVT2001SN生長；在毒素過表達試驗中可得知，過表達hipA基因會影響K. pneumoniae NVT2001SN的生長，此外R18H突變降低HipA的細胞毒性，而Q166H突變則使HipA具有較高的細胞毒性；在PAP試驗中可得知剔除hipA基因或剔除hipBA基因並不影響K. pneumoniae NVT2001SN在高濃度Levofloxacin環境下的存活率，但過表達hipA基因則可以提高其存活率。此外Q166H突變並不影響HipA提高細菌對抗抗生素的能力；D73E和A264S突變會使HipA的作用產生延遲但最終達到相同水平； R18H突變使HipA作用產生延遲且最終水平下降；V11A突變則使HipA失去作用。綜合以上結果可得知hipA基因確實可以抑制K. pneumoniae NVT2001SN生長並提高細菌對抗抗生素的能力，且胺基酸取代的存在及位點對於HipA至關重要，但其背後的機轉及原因仍須更進一步去了解。.
電子資源:	電子資源
館藏註:	(平裝)

評估克雷伯氏肺炎菌利用hipBA 毒素抗毒素系統表現頑固抗性之機轉= Assessing the persistence mechanism of hipA/hipB toxin/antitoxin system in Klebsiella pneumoniae/
劉冠宏

評估克雷伯氏肺炎菌利用hipBA 毒素抗毒素系統表現頑固抗性之機轉= Assessing the persistence mechanism of hipA/hipB toxin/antitoxin system in Klebsiella pneumoniae/ Assessing the persistence mechanism of hipA/hipB toxin/antitoxin system in Klebsiella pneumoniae劉冠宏 - [高雄市]: [撰者], 民111 - 95葉: 圖; 30公分

指導教授: 曾嵩斌.

碩士論文--高雄醫學大學醫學檢驗生物技術學系碩士班.

參考書目：葉.

目錄

克雷伯氏肺炎菌是一種伺機性感染的病原體，平時以正常菌叢的形式存在於健康人體腸道、呼吸道…等環境中，當人體免疫功能低下或產生缺陷時便會造成嚴重的感染，現今克雷伯氏肺炎菌抗藥性問題與日俱增，因此許多研究試圖釐清其中機制以尋求解決辦法。近年來研究發現細菌除了可透過基因突變或是獲得抗藥性基因的方式產生抗藥性以外，還存在一群基因型一致但表現型不同的亞族群可在長期的抗生素治療中存活，後來的研究將其命名為頑固性細菌 (persister cell)。頑固抗性 (persistence)被定義為正常細胞的表現型變異，細菌可以透過抑制生長的方式進入休眠狀態以暫時抵抗抗生素壓力，且當抗生素環境壓力被去除後便能夠重新恢復生長，而這樣的特性會導致病患反覆感染、治療難度上升。在過去的十年間許多學者試圖釐清頑固抗性的機制，而其中毒素抗毒素系統已被證實與頑固抗性具有高度相關性，其中又以第二型毒素抗毒素系統hipBA最廣為研究，當細菌面對環境壓力時，體內的蛋白酶會水解抗毒素從而釋出毒素，自由態的毒素會結合其標的使細菌生長受到抑制並從而誘導頑固抗性的表現。綜合上述，本研究試圖探討第二型毒素抗毒素系統hipBA對於K. pneumoniae頑固抗性表現的相關性，本實驗分析臨床收集共25隻Carbapenem-和colistin-resistant K. pneumoniae (CRKP)的hipA序列後，挑選3種位於HipB抗毒素辨認位的基因突變 (V11A、R18H、D73E)及3種位於調節下游基因的核酸結合位的基因突變 (Q166H、A264S、R385L)進行後續研究，並以自肝膿瘍病人分離出的克雷伯氏肺炎菌 (K. pneumoniae NVT2001SN)為原始株利用質體pKASsacB建構ΔhipA及ΔhipBA的突變菌株，且利用南方墨點法驗證基因剔除的正確性。此外，在調節表現質體pBAD18建構不同定點突變hipA後，以生長曲線、毒素過表達試驗及population analysis profile (PAP)等試驗探討hipBA基因是否影響細菌生長、抗生素頑固抗性的表現，以及該6種單一胺基酸取代對於HipA功能的影響。本研究結果顯示，在生長曲線實驗中發現剔除hipA或hipBA並不影響K. pneumoniae NVT2001SN生長；在毒素過表達試驗中可得知，過表達hipA基因會影響K. pneumoniae NVT2001SN的生長，此外R18H突變降低HipA的細胞毒性，而Q166H突變則使HipA具有較高的細胞毒性；在PAP試驗中可得知剔除hipA基因或剔除hipBA基因並不影響K. pneumoniae NVT2001SN在高濃度Levofloxacin環境下的存活率，但過表達hipA基因則可以提高其存活率。此外Q166H突變並不影響HipA提高細菌對抗抗生素的能力；D73E和A264S突變會使HipA的作用產生延遲但最終達到相同水平； R18H突變使HipA作用產生延遲且最終水平下降；V11A突變則使HipA失去作用。綜合以上結果可得知hipA基因確實可以抑制K. pneumoniae NVT2001SN生長並提高細菌對抗抗生素的能力，且胺基酸取代的存在及位點對於HipA至關重要，但其背後的機轉及原因仍須更進一步去了解。.

(平裝)Subjects--Index Terms:

hipA

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520 3 $a Klebsiella pneumoniae is an opportunistic pathogen that usually exsits in the intestines and respiratory tracts of healthy people. However, when the immune function decreasing or being defect, K. pneumoniae infects people seriously. Nowadays, given the problem of drug resistance in K. pneumoniae, lots of researches tried to clarify the mechanism and find a solution. Recently, a subgroup of bacteria with the same genotype but different phenotype can survive from long-term antibiotic treatment without gaining resistant gene or gene mutation, which was named persister cell. During the period of persistence, the bacterial growth would be arrested, and bacteria resists from antibiotic stress through the temporarily dormant state. With the persistence, bacteria could cause recurrent infection even duting antibiotic therapies. Over the past decade, many researcher tried to clarify the mechanism of persistence, Toxin-antitoxin systems have been reported to be highly correlated. Among all TA systems reported, hipBA which belong typeII TA system is the most well-studied. When bacteria being under stress, the protease hydrolyzes the antitoxin and helps release the toxin from the TA complex. The free-form toxin binds to its downstream regulons and induce the persistence. According to the problem, this study attempt to assess the persistence mechanism of hipBA in K. pneumoniae. We collected 25 CRKP from clinic, after analyzing the hipA sequence of them, we choose 3 amino acid substitution (V11A, R18H, and D73E) located in the antitoxin binding domain and 3 amino acid substitution (Q166H, A264S, and R385L) located in the nucleic acid binding site the regulates downstream genes. K. pneumoniae NVT2001SN isolated from liver abscess patient was used to construct ΔhipA and ΔhipBA mutant strain by using pKASsacB, and the validation of gene deletion was performed by Southern blot. Besides, the mutant hipA genes were contructed in an expression vector pBAD18 by using site-directed mutagenesis PCR. The growth curve were performed to explore the effect of gene deletion on cell growth. The toxin overexpression assay was performed to test the toxicity of hipA and other mutant hipA genes. The population analysis profile (PAP) were performed to explore the effects of hipA and other mutant hipA genes on persistence. In the results, the hipA and hipBA deletion showed no effect on cell growth. In the toxin overexpression assay, it can be known the overexpression could inhibit cell growth. In addition, HipA with R18H shows lowered ability to inhibit cell growth, but HipA with Q166H shows higher cytotoxicity against bacterial cells. PAP result shows that the deletion of hipA and hipBA did not affect the survival rate of K. pneumoniae NVT2001SN in high concentrate levofloxacin, but overexpression of hipA could improve its survival rate. The Q166H mutation on HipA still remained its function to induce persistance, whereas the D73E and A264S mutations possessed the delayed effects but eventually reached the same level. The R18H mutation on HipA was found with a reduced function to induce persistence, and further, the V11A mutation on HipA defected the ability. Based on all results above, it can be known that overexpression hipA gene can inhibit K. pneumoniae NVT2001SN growth and improve the survival under antibiotics. Although the amino acid substitution of HipA would affect the phenomenon, the mechanisms would need to be further studied..
563 $a (平裝)
653 # # $a hipA $a Klebsiella pneumoniae $a toxin/antitoxin system.
856 7 # $u https://handle.ncl.edu.tw/11296/kxc48f $z 電子資源 $2 http